人—山羊異質(zhì)胚胎構(gòu)建及胚胎干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

人胚胎干細(xì)胞（hESCs）有分化為機(jī)體各種細(xì)胞的潛能,是再生醫(yī)學(xué)、藥物篩選及發(fā)育研究的一個(gè)重要來源。hESCs是從人胚胎細(xì)胞分離培養(yǎng)而來的,然而,人胚胎來源不足嚴(yán)重限制了hESCs的研究。以動(dòng)物卵母細(xì)胞為受體、人體細(xì)胞為供體細(xì)胞的異質(zhì)核移植技術(shù)為hESCs的研究提供了新的途徑,本文嘗試了用山羊卵母細(xì)胞為受體、人包皮成纖維細(xì)胞（HFFs）為供體構(gòu)建人-山羊異質(zhì)核移植（human-goat interspecies nuclear transfer, hgiNT）胚胎,并分離hESCs,旨在優(yōu)化hgiNT方案,并為建立hESCs系提供技術(shù)幫助。研究內(nèi)容如下: 1.為了選擇遺傳均一的供體細(xì)胞用于核移植,本實(shí)驗(yàn)分別用條件培養(yǎng)液或用飼養(yǎng)層共培養(yǎng)對HFFs進(jìn)行克隆分離和擴(kuò)大培養(yǎng),對照組在無飼養(yǎng)層的新鮮培養(yǎng)液中培養(yǎng),Giemsa染色分析克隆細(xì)胞核型。結(jié)果:共培養(yǎng)組克隆存活率（31.43 %）顯著高于對照組（5.56 %）（P<0.05）,與條件培養(yǎng)液組相近（27.27 %,P>0.05）;飼養(yǎng)層共培養(yǎng)組擴(kuò)大培養(yǎng)率（11.43 %）顯著高于對照組（0 %）（P<0.05）。7個(gè)細(xì)胞克隆中5個(gè)表現(xiàn)為正常核型（2n=44+XY）。結(jié)果表明,兩種方法均能提高HFFs形成克隆的比例,且能保持細(xì)胞染色體核型正常,用于核移植前供體細(xì)胞的篩選。 2.為了探索hgiNT條件,本實(shí)驗(yàn)首先對電融合參數(shù)進(jìn)行了摸索,進(jìn)而測試了融合與激活間隔時(shí)間對重組胚胎體外發(fā)育的影響,zui后對比了mSOFaa和G1/G2序貫培養(yǎng)法對重組胚胎體外發(fā)育的影響。結(jié)果*的融合電壓、脈沖時(shí)程和脈沖次數(shù)分別為36 V、20μs和2次,*的融合與激活間隔時(shí)間為4 h,G1/G2序貫培養(yǎng)法的卵裂率和囊胚率均顯著高于mSOFaa培養(yǎng)法（71.81 % vs. 64.78 %,9.73 % vs. 4.76 %;P<0.05）。結(jié)果表明:hgiNT的電融合參數(shù)及融合與激活間隔時(shí)間與受體卵母細(xì)胞供應(yīng)方（山羊）體細(xì)胞核移植相似,而核移植胚胎的培養(yǎng)條件傾向于供體細(xì)胞供應(yīng)方（人）的胚胎培養(yǎng)條件。 3.本研究探討了TSA對供體細(xì)胞或重構(gòu)胚處理對hgiNT胚胎發(fā)育的影響。選擇經(jīng)5、25、50、75、100 nM TSA處理24 h的山羊胎兒成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞進(jìn)行核移植,結(jié)果在50、75 nM組,囊胚率有所增高（9.91 %、12.10 % vs. 8.47 %,P>0.05）;用5,25,50,75或100 nM TSA處理重構(gòu)胚10 h,結(jié)果5、25、50、75 nM組的囊胚率均有所提高,其中25 nM組顯著高于對照組（16.41 % vs. 7.63 %,P<0.05）。TSA處理供體細(xì)胞和重構(gòu)胚均能顯著提高克隆胚囊率,說明低甲基化的供體細(xì)胞有利于卵母細(xì)胞的重編程,推測TSA可能降低了核移植后供體細(xì)胞組蛋白去乙酰化水平,因而提高了克隆胚的發(fā)育率。 4.本實(shí)驗(yàn)（1）用10 mg/L的絲裂霉素-C分別處理HFFs、MEFCs和GEFCs飼養(yǎng)層1.5 h、2 h、2.5 h、3 h,冷凍-復(fù)蘇后培養(yǎng)12 h,統(tǒng)計(jì)復(fù)蘇率,選擇合適的處理時(shí)間;（2）用HFFs、MEFCs和GEFCs作飼養(yǎng)層,接種ICM,比較它們對hESCs的支持情況;（3）在不同密度的HFFs飼養(yǎng)層上,接種相同的ICM數(shù),統(tǒng)計(jì)hESCs的貼壁率、克隆形成率、分化率,從中選擇合適的飼養(yǎng)層密度。結(jié)果顯示:（1）以10 mg/L絲裂霉素-C*處理時(shí)間為2 h;（2）HFFs和MEFCs飼養(yǎng)層均能有效地支持hESCs增殖和保持未分化狀態(tài);（3）HFFs飼養(yǎng)層的*密度是3×104/mL。 五、為了克服培養(yǎng)體系中異源性成份污染hESCs臨床應(yīng)用的限制,本實(shí)驗(yàn)采用無動(dòng)物源性成份確定的HESCO體系對hgiNT胚胎來源的hESCs（iNT-hESCs）進(jìn)行體外培養(yǎng)（HESCO組）,以HFFs為飼養(yǎng)層的常規(guī)培養(yǎng)體系為對照組（HFF組）,觀察iNT-hESCs在兩種培養(yǎng)體系中的生長狀況,探討HESCO體系對iNT-hESCs生長的支持情況。結(jié)果,HESCO組的iNT-hESCs有與HFF組相似的細(xì)胞形態(tài)、增殖速度、堿性磷酸酶活性和遺傳穩(wěn)定性;結(jié)果表明HESCO培養(yǎng)體系能支持iNT-hESCs的生長并能保持其未分化狀態(tài),這對iNT-hESCs用于臨床治療且有重要意義。