細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因與硬皮病

摘要 急性活動(dòng)期的硬皮病皮損有內(nèi)皮細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。成纖維細(xì)胞在與內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)，其增生速度較單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)快，而膠原合成量較單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)少。凋亡相關(guān)基因c-myc、bcl-2及fas系統(tǒng)在硬皮病患者中有異常表達(dá)。進(jìn)一步研究細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)與硬皮病的關(guān)系。有助于進(jìn)一步研究硬皮病的發(fā)病機(jī)理，及探計(jì)新的治療手段。

　細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序性的死亡。隨著細(xì)胞凋亡研究的進(jìn)展，已發(fā)現(xiàn)許多疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程與凋亡現(xiàn)象密切相關(guān)[1]。有研究發(fā)現(xiàn)光化學(xué)療法治療硬皮病，可增加患者外周血淋巴細(xì)胞Fas的表達(dá)及細(xì)胞凋亡數(shù)，這提示光化學(xué)療法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡也許是其治療硬皮病的重要機(jī)制之一[2，3]。就細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因與硬皮病的關(guān)系綜述如下。

　　細(xì)胞凋亡

　　uCD（University of California at Davis）系200及206小雞能自發(fā)產(chǎn)生硬皮病樣病變，具有血管閉塞、皮膚和內(nèi)臟血管周圍淋巴結(jié)細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化、遠(yuǎn)端多關(guān)節(jié)炎等表現(xiàn)，以及抗核抗體、抗心磷脂抗體、類風(fēng)濕因子等免疫學(xué)異常，這均與人系統(tǒng)性硬皮病（SSc）病變特點(diǎn)相似[4-6]。Sagonc等[7]用TUNEL法及免疫熒光研究73只UCD系200及206雞、15例SSc患者（8例慢性硬化期、7例急性水腫期）、9例局限性硬皮病（loSc）（急性炎癥期）、3例瘢痕疙瘩的皮損，發(fā)現(xiàn)急性SSc和loSc皮損深層均有細(xì)胞凋亡，通過(guò)vWf（內(nèi)皮細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志）雙染表明大多數(shù)凋亡細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞。與急性期相對(duì)應(yīng)的硬皮病病雞，其中的浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞也正發(fā)生凋亡。UCD系200及206雞在出現(xiàn)臨床可見(jiàn)的硬皮病表現(xiàn)之前，其深層即出現(xiàn)凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞，隨后淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞（Fb）及其它細(xì)胞也發(fā)生凋亡。而正常對(duì)照、瘢痕疙瘩及8例慢性纖維化的SSc則未見(jiàn)細(xì)胞凋亡。Bordron等[8]通過(guò)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體（AECA）共同孵育，證實(shí)不但SSc患者的AECA可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而且鼠抗人內(nèi)皮細(xì)胞單克隆抗體也可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，但誘導(dǎo)調(diào)亡的AECA不識(shí)別Fas配體。Denton等[9]將Fb與內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Ssc的Fb*融合時(shí)的細(xì)胞數(shù)、H3-TdR的攝取量明顯比單獨(dú)培養(yǎng)高（P分別為0.004,0.002），而膠原產(chǎn)量明顯低于單獨(dú)培養(yǎng)（P=0.02）；正常Fb*融合時(shí)的細(xì)胞數(shù)高于單獨(dú)培養(yǎng)，但無(wú)顯著性差異（P=0.08），H3-TdR的攝取量明顯高于單獨(dú)培養(yǎng)（P=0.04），而膠原產(chǎn)量低于單獨(dú)培養(yǎng)，但無(wú)顯著性差異（P=0.45）。顯然，內(nèi)皮細(xì)胞的存在對(duì)SSc的Fb及正常Fb的生物學(xué)特性均有影響。

　　凋亡相關(guān)基因

　　（一）c-myc基因：c-myc基因是一種原癌基因，其表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞增殖，也能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。c-myc信號(hào)系統(tǒng)被激活以后，如果培養(yǎng)體系中有足夠的生長(zhǎng)因子持續(xù)作用，則細(xì)胞增殖分裂，否則便誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[10]。培養(yǎng)基中血清濃度降低時(shí)，F(xiàn)b是否發(fā)生凋亡及細(xì)胞亡亡率均取決于c-myc蛋白表達(dá)水平，細(xì)胞凋亡率與c-myc表達(dá)水平呈正相關(guān)[11]。

　　1．培養(yǎng)Fb的c-my基因的表達(dá)：Trojanowska等比較培養(yǎng)的硬皮病皮損及正常人皮膚Fb的c-myc基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)血清濃度低時(shí)（1%血清），硬皮病皮損Fb的c-myc表達(dá)水平是正常的Fb的2.5～3倍，同時(shí)硬皮病Fb的增生也較正常Fb快。不過(guò)加入10%新鮮血清后，c-myc的增高就不明顯[12]。Feghali等[13]檢測(cè)培養(yǎng)的SSc皮損區(qū)、非皮損區(qū)及正常皮膚Fb的c-myc的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SSc皮損Fb的c-myc mRNA水平較其它Fb增高1.5～5.6倍，作者認(rèn)為c-myc表達(dá)增高也許是SSc患者Fb活化的指標(biāo)。

　　2．外周血淋巴細(xì)胞c-myc的表達(dá)：Kahan等[14]用RNA雜交技術(shù)檢測(cè)17例皮膚彌漫性系統(tǒng)性硬皮病（deSSc）患者及8例正常人外周血淋巴細(xì)胞c-myc的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)deSSc患者T淋巴細(xì)胞的c-myc水平明顯高于正常對(duì)照（P＜0.02＝，且早期、活動(dòng)期SSc患者T淋巴細(xì)胞的c-myc水平較非活動(dòng)期高；B淋巴細(xì)胞的c-myc表達(dá)稍高于正常人，但差異無(wú)顯著性。這表明SSc患者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的活化在疾病的發(fā)生中可能有重要作用。

　　（二）bcl-2基因：bcl-2也是一種原癌基因，編碼產(chǎn)物分子量為26000的蛋白分子，在正常細(xì)胞的激活和發(fā)育過(guò)程中表達(dá)，而在成熟的或走向凋亡的細(xì)胞中呈低表達(dá)或不表達(dá)[1]，bcl-2的表達(dá)可抑制許多細(xì)胞的凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞的存活期[10，15]。Wang等[16]研究培養(yǎng)的人及鼠Fb，發(fā)現(xiàn)衰老的Fb的（58代）能耐受血清減少誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這與其持續(xù)表達(dá)高于水平bcl-2相關(guān)。Nambu等[17]用免疫組化療法檢測(cè)25例膠原血管疾病（9例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，9例進(jìn)行性SSc，4例多發(fā)性肌炎/皮肌炎，2例干燥綜合征，1例SLE）及10例特發(fā)性間質(zhì)性肺炎bcl-2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)bcl-2蛋白的表達(dá)主要在浸潤(rùn)肺泡間質(zhì)的T淋巴細(xì)胞及淋巴濾泡皮質(zhì)的B淋巴細(xì)胞。在膠原血管性疾病中，bcl-2蛋白在T淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平與肺泡內(nèi)的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目緊密相關(guān)。還有研究表明硬皮病患者外周血淋巴細(xì)胞bcl-2有過(guò)度的表達(dá)[2]。

　　（三）Fas系統(tǒng)：Fas系統(tǒng)又稱作APO-1，屬腫瘤壞死因子受體/神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體超家族成員。1993年人白細(xì)胞分型會(huì)議統(tǒng)一命名為CD95。Fas基因編碼產(chǎn)物為分子量45000的跨膜蛋白，較廣泛地分布于多種類型細(xì)胞，包括胸腺細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞等。Fas蛋白與Fas配體組成Fas系統(tǒng)，二者的結(jié)合導(dǎo)致靶細(xì)胞走向凋亡。Fas配體主要表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞表面，因此認(rèn)為Fas系統(tǒng)的相互作用是細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）殺傷的主要分子機(jī)制[1，18]。Aringer等[2]用流式細(xì)胞儀檢測(cè)硬皮病患者外周血淋巴細(xì)胞Fas的表達(dá)，患者與正常人無(wú)差異。然而Wetzig等[19]用夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)30例SSc及15例正常對(duì)照血清可溶性Fas水平發(fā)現(xiàn)SSc患者血清可溶性Fas水平明顯高于正常對(duì)照，不過(guò)皮膚局限性系統(tǒng)性硬皮病（即肢端型，lcSSc）與dcSSc患者血清可溶性Fas水平比較無(wú)明顯差異，可溶性Fas水平與炎癥活動(dòng)期也缺少相關(guān)性。

　　結(jié)語(yǔ)

　　硬皮病是一種多系統(tǒng)疾病，其病因及發(fā)病機(jī)理尚不清楚，近來(lái)的研究證實(shí)血管內(nèi)皮損傷、免疫細(xì)胞活化、Fb增生、膠原合成過(guò)多等均參與其發(fā)病[20]。綜合上述研究結(jié)果，早期內(nèi)皮細(xì)胞凋亡也許是硬皮病患者內(nèi)皮損傷的主要證據(jù)，內(nèi)皮細(xì)胞的存在能影響Fb的生物學(xué)特性。凋亡相關(guān)基因bcl-2、c-myc及Fas系統(tǒng)在硬皮病均有異常表達(dá)，這也許是Fb、淋巴細(xì)胞活化的標(biāo)志。但內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)亡對(duì)Fb生物特性的影響，以及凋亡相關(guān)基因異常表達(dá)與Fb膠原合成過(guò)多的關(guān)系還需要進(jìn)一步探討。因此，進(jìn)一步研究細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)與硬皮病的關(guān)系，有助于進(jìn)一步研究硬皮病的發(fā)病機(jī)理及探討新的治療手段。

　　本文所用主要縮寫：UCD：University of California at Davis,SSc:系統(tǒng)性硬皮病，loSc:局限性硬皮病，AECA：抗內(nèi)皮細(xì)胞抗體，F(xiàn)b：成纖維細(xì)胞，dcSSc：皮膚彌漫性系統(tǒng)硬皮病，leSSc：皮膚局限性系統(tǒng)性硬皮病（即肢端型）